Characterization and functional analysis of the Gp1 accessory lysis protein in Mycobacterium smegmatis infection by the Mycobacteriophage Ms6

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010The majority of phages described to date (≈96%) is endowed with a tail and presents a double-stranded DNA (dsDNA) genome. Each infection cycle terminates with the strictly programmed and regulated lysis of the host brought about by two phage-encoded proteins, a murein-degrading enzyme, the endolysin, which is essential in achieving rapid hydrolysis of cell wall peptidoglycan, and a second membrane-embedded protein, the holin, which serves to release or activate the endolysin at a precisely defined time, thus bringing about an effective burst of the infected host. Targeting of endolysins to peptidoglycan can be achieved in two ways: through pore formation by canonical holins at a defined time or by continuous export of endolysins endowed with export signals during synthesis, assisted by the host Sec translocon. Mycobacteriophage Ms6 is a temperate bacteriophage that infects Mycobacterium smegmatis and possesses an unusual lytic cassette: in addition to the endolysin-holin lysis system encoded by genes lysA (gp2) and hol (gp4) respectively, the Ms6 lytic cassette comprises three accessory lysis proteins encoded by genes gp1, gp3 (lysB) and gp5 that are restricted to mycobacteriophages. Mycobacteria are Gram-positive bacteria that have evolved a complex cell wall, comprising a peptidoglycan-arabinogalactan polymer with covalently bound mycolic acids of considerable size, a variety of extractable lipids, and pore-forming proteins which provide an extraordinary efficient permeability barrier to noxious compounds and contribute to the high intrinsic resistance of mycobacteria to many drugs. To overcome the disadvantage that a complex cell wall may represents for a successful infective cycle, mycobacteriophages have evolved new lysis strategies by acquiring, through their evolution, genes that likely confer a substantial selective advantage over those without them by providing faster and more complete lysis. The present work underscores a new model for endolysin export in mycobacteriophage Ms6. Several lines of evidence indicate that gp1 encodes a secretion chaperone-like protein that binds the endolysin, assists the export to the extracytoplasmic environment independently of holin function and is required to accomplish an efficient lysis of M. smegmatis. Construction of different Ms6 derivatives deleted in different regions of the lysis operon demonstrated that the gene products of hol and gp5, although nonessential for phage viability, appear to play a role in controlling the timing of lysis. Remarkably, during M. smegmatis infection two endolysin forms (Lysin384 and Lysin241) are synthesized and both enzymes were shown to be essential for the normal timing, progression and completion of host cell lysis. In conclusion, this work highlights the role of the accessory lysis protein Gp1 and revealed alternative pathways for mycobacteria lysis, demonstrating that the presence of the mycobacterium-specific lysis factor Gp1, may confer a selective advantage not only for fitness under different environmental conditions but also as an alternative to lysis exclusively holin-dependent. Mycobacteriophages – Molecular chaperones – Holins – Endolysins - Lysis timing - Phage therapy - MycobacteriaMycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, permanece como uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo. Esta realidade alarmante despertou um interesse renovado nas possibilidades terapêuticas dos bacteriófagos (vírus que infectam bactérias) e das sua proteínas líticas devido à capacidade de libertarem a progenia viral através da lise da célula hospedeira. A maioria dos fagos descritos até à data (≈96%) apresenta cauda e um genoma de DNA de cadeia dupla. Para induzirem uma lise efectiva do hospedeiro, estes bacteriófagos utilizam a estratégia “holina-endolisina” e sintetizam uma enzima, a endolisina, essencial para a hidrólise rápida do peptidoglicano e uma segunda proteína membranar, a holina, que permite a libertação ou activação da endolisina num período de tempo bem definido. O bacteriófago Ms6 é um micobacteriófago temperado que infecta Mycobacterium smegmatis. Como acontece com todos os fagos de DNA de cadeia dupla, o seu operão lítico codifica para os dois genes essenciais para a lise do hospedeiro: a endolisina com actividade de amidase codificada pelo gene lysA (gp2) e a holina codificada pelo gene hol (gp4). Estes dois genes fazem parte de uma unidade de transcrição juntamente com os genes gp1, gp3 (lysB) e gp5. Estudos prévios demonstraram que a expressão dos dois primeiros genes do operão lítico (gp1 e lysA) na ausência da holina, é suficiente para induzir a lise de E. coli, um fenótipo não observado na ausência de gp1 ou com a expressão da endolisina apenas. gp1 é o primeiro gene do operão de lise do micobacteriófago Ms6 e encontra-se localizado imediatamente a montante da endolisina. Codifica para uma pequena proteína de 77 aminoácidos que apresenta similaridade apenas com outras proteínas de micobacteriófagos, com função desconhecida. Apesar da inibição do crescimento de E. coli quando a proteína Gp1 é sobreexpressa, a estrutura secundária da sua sequência de aminoácidos não apresenta as características estruturais das holinas. A grande maioria das endolisinas descritas não possui uma sequência sinal para a secreção e dependem inteiramente das holinas para serem libertadas para o peptidoglicano. No entanto, estudos realizados revelaram a presença de um péptido sinal em N-terminal nas endolisinas de alguns fagos que infectam bactérias Gram-positivas como por exemplo, os bacteriófagos fOg44 de Oenococcus oeni e φg1e de Lactobacillus plantarum. Para atingirem o peptidoglicano, as endolisinas destes fagos requerem a actividade do sistema de secreção Sec de E. coli para a sua exportação, e não a formação de lesões membranares pelas holinas. Particularmente interessante é o caso das endolisinas do fago P1 e 21 de E. coli que possuem uma sequência SAR (Signal-Arrest-Release Sequence) em N-terminal que lhes permite serem transportadas pelo sistema Sec até ao peptidoglicano. A análise bioinformática da sequência de aminoácidos de LysA não previu uma sequência sinal para a secreção não estando igualmente identificadas sequências SAR em endolisinas de outros micobateriófagos, o que parece indicar que a translocação desta proteína através da membrana citoplasmática está dependente dos outros genes de lise. No presente estudo, investigou-se o envolvimento da proteína acessória de lise Gp1 no transporte da endolisina através da membrana citoplasmática e a função das holinas Hol e Gp5 na regulação do tempo de lise em M. smegmatis. Foi também estudada a função da endolisina durante a infecção das micobactérias e o seu espectro de actividade lítica. Na primeira parte do trabalho, os resultados obtidos demonstraram que em E. coli a co-expressão das proteínas Gp1 e LysA (endolisina) é suficiente para obter um efeito lítico na ausência da holina. No entanto, Gp1 não pertence à classe das holinas, apresentando características estruturais e bioquímicas de chaperone molecular, como um baixo peso molecular (<15 kDa), um ponto isoeléctrico acídico e a capacidade de formação de dímeros. Experiências de interação de proteínas por crosslinking em E. coli, demonstraram que Gp1 interage com a endolisina LysA através de ligação com os primeiros 60 aminoácidos N-terminais da enzima, sendo esta região necessária e suficiente para a interacção. De facto, durante a infecção de M. smegmatis pelo Ms6 esta interacção também ocorre e a oligomerização de Gp1 parece ser necessária para este processo. A delecção de gp1 do operão de lise do bacteriófago Ms6 demonstrou que, embora Gp1 não seja essencial para a obtenção de um fenótipo de lise, é necessária para uma lise eficiente de M. smegmatis e para a libertação da progenia viral. Tendo em consideração que tanto em E. coli como em M. smegmatis, a holina não é necessária para a lise, a sua função durante o ciclo de infecção foi estudada. A análise da sequência aminoacídica de Hol revelou a presença na região N-terminal da proteína de uma sequência SAR seguida de uma região transmembranar, características das pinholinas. Investigou-se ainda a função da proteína Gp5, que embora possuindo também características estruturais de holina, não é essencial para a lise de M. smegmatis. Utilizando a técnica de recombineering, construiram-se diferentes fagos derivados do Ms6, deleccionados em diferentes genes líticos e estudou-se o efeito dessas delecções no seu ciclo de replicação após a infecção dos hospedeiro. Observou-se que Hol e Gp5, embora não sejam essenciais para a viabilidade do bacteriófago, parecem ter um papel na regulação do tempo de lise: a delecção de hol causou uma lise precoce enquanto que a delecção de gp5 retardou o tempo de lise. Por outro lado observou-se também que a presença de ambas as proteínas durante a infecção é essencial para obter a lise do hospedeiro no tempo de lise programado. Por fim, na terceira parte do trabalho, estudou-se a função durante o ciclo lítico das duas endolisinas (Lisina384 e Lisina241) codificadas pelo gene lysA. A análise da sequência nucleotídica de lysA revelou a presença de um gene de lise adicional codificado na mesma fase de leitura, e precedido por sinais de tradução (um codão de iniciação GTG e um local de ligação ao ribossoma). Embora a endolisina se tenha revelado essencial para a lise de M. smegmatis (um derivado do Ms6 deleccionado no gene lysA não é viável), bacteriófagos derivados do Ms6 defectivos na síntese da lisina384 ou da lisina241 embora sejam viáveis, apresentam um ciclo de infecção defectivo. A proteína Gp1 demonstrou ser essencial para a síntese ou estabilidade da lisina384 mas não da lisina241, embora não pareça participar na função final desta proteína, nem na sua activação ou conformação. Ambas as endolisinas possuem actividade lítica em diferentes bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e micobactérias quando adicionadas exogenamente. Em resumo, o presente trabalho demonstra a importância da proteína acessória de lise Gp1, não só na translocação da lisina384 através da membrana citoplasmática, mas também para uma lise eficiente de M. smegmatis. Por outro lado, estes estudos revelaram a existência, no micobacteriófago Ms6, de vias alternativas de lise através da presença, no seu genoma, de proteínas de lise adicionais (para além do sistema holina-endolisina) e exclusivas deste grupo de fagos. Devido à complexidade da parede celular micobacteriana e da barreira que poderá representar para um ciclo de infecção bem sucedido, estas proteínas de lise acessórias poderão conferir uma vantagem selectiva, não só em termos evolutivos durante a infecção em diferentes condições ambientais, mas também como uma alternativa viável para uma lise exclusivamente dependente da holina. A caracterização dos mecanismos de lise das micobactérias pelos micobacteriófagos e um conhecimento das vias exactas pelas quais as enzimas efectoras da lise são posicionadas junto do seu substracto, poderá contribuir para a identificação de novos alvos terapêuticos na parede das micobactérias. Micobacteriófagos – Tempo de lise – Chaperones moleculares – Holinas – Endolisinas – Terapia Fágica - MicobactériasFundação para a Ciência e Tecnologia (FCT, SFRH/BD/24452/2005), Lisbon, Portugal. This work was supported by grant PTDC/SAU-FCF/73017/2006 (to M. P.) from FCT, Portugal

Impacte das alterações climáticas nas necessidades de rega das culturas

Conhecidos os valores diários das variáveis meteorológicas evapotranspiração de referência (ETo) e precipitação (P) para a série de controlo e para as séries referentes aos vários cenários das alterações climáticas, pode-se estimar as necessidades de rega relativas a cada um dos cenários referidos através da simulação do balanço hídrico dos solos. Para o efeito, é ainda necessário conhecer os parâmetros hidrológicos dos solos e os parâmetros das culturas. Para a realização do balanço hídrico foi desenvolvido uma ferramenta informática que permite fazer o balanço hídrico sequencial de uma cultura ou de uma rotação de culturas

Milk production as an indicator of drought vulnerability of cities located in the brazilian semiarid region

Several spectral indices have been used to estimate droughts, however, these indicators only give evidence of a dry spell leaving out its impacts on significant economic activities performed in a given region. In this context, livestock breeding in one of the most important activities to analyze in the Brazilian semiarid region. The aim of this study was to evaluate the relationship between the drought indices, obtained through remote sensory devices, and annual milk production (2004 – 2014), identifying the most affected cities by the drought and were considered the most vulnerable and in need of special attention during dry periods. In order to analyze the data, the hierarchical grouping technique and correlation analyses between milk production and VCI - Vegetation Condition Index, TCI - Temperature Condition Index, VHI - Vegetation Health Index, PCI - Precipitation Condition Index and SDCI - Scaled Drought Condition indices were used. The intense correlation between milk production and the drought indices may be related to the dependency of the cities’ economies on natural resources. On the other hand, the diversification of the cities’ economic activities may enable access to various resources and drought vulnerability reductioninfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Assessing the benefits of capacity payment, feed-in-tariff and time-of-use programme on long-term renewable energy sources integration

Recently, demand response programmes (DRPs) have captured great attention in electric power systems. DRPs such as time-of-use (ToU) programme can be efficiently employed in the power system planning to reform the long-term behaviour of the load demands. The composite generation expansion planning (GEP) and transmission expansion planning (TEP) known as composite GEP–TEP is of high significance in power systems to meet the future load demand of the system and also integrate renewable energy sources (RESs). In this regard, this study presents a dynamic optimisation framework for the composite GEP–TEP problem taking into consideration the ToU programme and also, the incentive-based and supportive programmes. Accordingly, the performances of the capacity payment and feed-in tariff mechanisms and the ToU programme in integrating RESs and reducing the total cost have been evaluated in this study. The problem has been formulated and solved as a standard two-stage mixed-integer linear programming model aimed at minimising the total costs. In this model, the ToU programme is applied and the results are fed into the expansion planning problem as the input. The proposed framework is simulated on the IEEE Reliability Test System to verify the effectiveness of the model and discuss the results obtained from implementing the mentioned mechanisms to support the RESs integration

A system dynamics approach to study the long-term interaction of the natural gas market and electricity market comprising high penetration of renewable energy resources

Due to the gas consumption of some power plants for electricity generation and providing an acceptable level of flexibility, the interaction of natural gas markets and electricity markets is inevitable. One of the main challenges of policymakers in the energy sector coupling is the investigation of such interactions. Our main goal is to analyze the effect of the penetration of renewable energy resources on the behavior of gas markets and vice versa from the policymaker’s viewpoint. Moreover, we tend to study the effect of an external shock on the behavior of the whole system and the role of renewable resources in mitigating these side effects. Therefore, we used System Dynamic Approach to model the long-term behavior of the natural gas markets to extend the existed models of the electricity markets behavior and couple these markets. The Net Present Value method was used for the economic assessment of the investment in the development of gas reserves, and new stock and flow variables were defined to simulate this development. The simulations are performed for four scenarios by using a valid case study. Considering the results of simulations and sensitivity analysis, as the wind capacity incentive rose, the gas and electricity prices declined and their fluctuation increased during the time horizon. Although the effect of the gas market shock on the system depends on the time of occurrence, as the penetration of renewable units increased, the severity of its side effects decreased and the price jumps in the markets were mitigated.© 2022 The Authors. Published by Elsevier Ltd. This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).fi=vertaisarvioitu|en=peerReviewed

Ground motion and tectonics in the Terceira Island: Tectonomagmatic interactions in an oceanic rift (Terceira Rift, Azores Triple Junction)

The interpretation of high-resolution topography/bathymetry, GPS and InSAR data, and detailed structural geology indicate that: (1) Terceira developed at the intersection of two major volcano-tectonic lineaments: WNW-ESE(localTR'sdirection)andNNW-SSE(submarinechainofvolcanoes,here fi rstlyrecognisedandcoined Terceira Seamount Chain). (2) Terceira is affected by four main fault systems: the ca. N165° (normal faults dipping to east and west, mostly across the middle of the island), the N140° (normal faults mostly making up the Lajes Graben), the N110° (faults with oblique striations – normal dextral, making up the main volcanic line- ament), and the more subtle N70° (the transform direction related to the Nubia/Eurasia plate boundary). Seis- micity, GPS data and faults displacing the topography indicate that all systems are active. (3) The whole island is subsiding at a rate of ca. 5 mm/yr, as attested by both GPS and InSAR data, which is exceptionally high for the Azores islands. Common explanations like thermal contraction, or bending of the lithosphere, or magmatic processes, or collapse of the island under its own weight likely cannot justify the observed subsidence rate. The estimated average of TR's subsidence rate is also not enough, therefore we conclude that the measured 5 mm/yr can be a peak. (4) The fault geometry and kinematics are consistent with the current direction of maximum extension in the Azores (ca. N65°), and the rotation of Nubia relative to Eurasia. (5) Given that the NEshoulderoftheLajes Graben ismovingupwards at5 mm/yrand sits directlyontheTR'sNEshoulder,wecon- cludethattheTR'sshoulderismovingup,mostlikelyasaresultoftheelasticreboundassociatedwithrifting.The elasticreboundinbothNEandSWTR'sshouldersismostlikelyresponsiblefortheobservedridgemorphologyall along the TR

Métodos baseados em árvores para meta-aprendizagem

O presente projeto visa criar um método automático para seleção do algoritmo de análise de dados que servirá para resolver problemas de classificação. Sendo que para a realização do presente estudo várias etapas foram realizadas. A primeira etapa centrou-se essencialmente na pesquisa e investigação do tema no sentido de adquirir conhecimento na área. O objetivo passa por implementar uma ideia nova para fazer meta-aprendizagem através do desenvolvimento de um classificador capaz de classificar novos problemas. No entanto e para que seja possível esta implementação será necessário recolher dados no sentido de “alimentar” o classificador. A recolha dos dados passa por analisar diversos datasets e extrair conhecimento/características de cada uma deles com o objetivo de criar uma base de dados que servirá de input ao classificador. A fase de recolha de dados será descrita e detalhada nas secções seguintes deste projeto. Uma vez criado a base de dados de treino do classificador segue-se a próxima etapa que se centra na criação deste. O classificador terá como base o algoritmo árvore de decisão sendo este alvo de parametrizações no sentido de o otimizar. Numa fase posterior ao desenvolvimento de um meta-dataset e de um meta-modelo será possível verificar o comportamento deste uma vez colocado em produção. Existe um problema de classificação novo que será “consumido” pelo meta-modelo e este baseado em dados históricos classificará o problema, ou seja, sugere o melhor algoritmo de análise de dados. Desta forma será possível desenvolver/contribuir com uma base de dados com informação/características de diversos datasets assim como um classificador capaz de sugerir o melhor algoritmo de análise de dados

O Papel do Consultor Fiscal na Auditoria Fianceira Externa - Relatório de Estágio - Departamento Fiscal da EY - FSO TAX

O presente relatório tem como objetivo a análise e aplicação das competências adquiridas no estágio realizado na Ernst & Young S. A. (EY), no escritório de Lisboa pelo período de seis meses. Neste sentido, o presente documento contempla uma apresentação da EY, quer a nível nacional, quer a nível global. Na medida em que o estágio realizado desenvolveu-se no departamento fiscal, mais especificamente, na área de serviços financeiros – banca e seguradoras, o presente relatório visa explicar em que consiste a intervenção do consultor fiscal no processo de auditoria financeira externa, sendo numa fase inicial, feita uma exposição teórica abordando alguns dos principais procedimentos realizados no decorrer de uma auditoria financeira assim com as principais fases com que um auditor se depara ao longo do seu trabalho, servindo esta de base à compressão das tarefas executadas no decorrer do estágio. Deste modo, serão descritos os procedimentos realizados e tarefas executadas pelo consultor fiscal no apoio à confirmação do passivo por imposto corrente e diferido, revisão das obrigações declarativas fiscais e de pagamento de imposto, apoio na confirmação da adequabilidade do preenchimento de diversas obrigações declarativas e validação do apuramento de impostos a entregar ao Estado, salientando exemplos práticos nas diferentes fases. Adicionalmente será abordado o trabalho desenvolvido enquanto consultor fiscal de um banco presente em Portugal há mais de três décadas

Modeling, control and simulation of full-power converter wind turbines equipped with permanent magnet synchronous generator

In this paper, two wind turbines equipped with a permanent magnet synchronous generator (PMSG) and respectively with a two-level or a multilevel converter are simulated in order to access the malfunction transient performance. Three different drive train mass models, respectively, one, two and three mass models, are considered in order to model the bending flexibility of the blades. Moreover, a fractional-order control strategy is studied comparatively to a classical integer-order control strategy. Computer simulations are carried out, and conclusions about the total harmonic distortion (THD) of the electric current injected into the electric grid are in favor of the fractional-order control strategy